镍离子金属鳌合亲和层析介质说明书

1       简介

金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Fe³⁺发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。

镍NTA亲和层析介质具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。

2       性能参数：

 

3       适用范围

分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。

4       应用实例

4.1 实验名称：Ni-亲和层析介质分离带His标签的重组融合蛋白

实验步骤：

1、将菌体超声破碎，破碎过程避免温度过热引起蛋白失活；

2、将细胞破碎液高速离心，上清蛋白用0.45um滤膜过滤，得到上样蛋白溶液；

3、装Ni-亲和填料，1.6×20cm层析柱，柱床体积为10ml；

4、用缓冲液A平衡5个柱床体积，流速为1ml/min；

5、上样，流速为1ml/min；

6、用缓冲液A再洗2~5个柱床体积，流速为1ml/min；

7、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液B进行阶段洗脱，流速为1ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；

 8、用纯水流洗至少5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存。

 

缓冲液组成：

缓冲液A：50mM pH7.4的PBS缓冲液。

缓冲液B：50mM磷酸盐缓冲液+不同浓度的咪唑，pH7.4

 

4.2 使用Ni-亲和层析介质纯化His标签重组蛋白包涵体

如果对表达出来的菌体进行SDS-PAGE电泳后发现目的蛋白是包涵体，则需要对包涵体进行变性，重用的变性剂为6M盐酸胍代替8M脲，或其他更强烈的变性剂。

 

实验步骤：

1、向菌体中加入缓冲液重悬：缓冲液：PBS， 10%甘油，6M盐酸胍或者8M脲，PMSF，pH7.4；（PMSF用无水乙醇配制成200 mM储存液，-20°C或4°C保存；PMSF使用的工作浓度位1 mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前）

2、将菌体超声破碎，破碎过程避免温度过热引起蛋白失活；

3、将细胞破碎液高速离心，上清蛋白用0.45um滤膜过滤，得到上样蛋白溶液，上样蛋白需做电泳以验证包涵体是否变性变为可溶蛋白；

4、装Ni-亲和填料，1.6×20cm层析柱，柱床体积为10ml；

5、用缓冲液A平衡5个柱床体积，流速为1ml/min；

6、上样，流速为1ml/min；

7、用缓冲液A再洗2~5个柱床体积，流速为1ml/min；

8、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液B进行阶段洗脱，流速为1ml/min，收集各阶段洗脱峰，做SDS-PAGE电泳检测；

 9、用纯水流洗至少5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存。

 

缓冲液组成：

缓冲液A：50mM pH7.4的PBS缓冲液。

缓冲液B：50mM磷酸盐缓冲液+不同浓度的咪唑，pH7.4

 

5       应用注意事项：

镍离子金属螯合亲和层析介质最经典的配体是IDA。镍离子有六个螯合价数，Ni-IDA螯合了三价，剩余三价；而Ni-NTA螯合四价，剩余两价，因此Ni-IDA琼脂糖凝胶作用力要比Ni-NTA琼脂糖凝胶的强。也正因为这个原因，在同样条件下Ni-IDA洗杂质和目标蛋白的要比Ni-NTA的咪唑浓度高，但是NTA的填料更稳定，耐受更强的还原剂，更不容易脱落；而IDA的载量要比NTA高，可以反复利用，更加经济。具体用哪个填料完全看个人的习惯以及纯化的条件而决定。

6       有关操作说明

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）在柱下端加入蒸馏水，以除去柱中空气，关闭柱出口，在柱内保留少量蒸馏水。

（3）将介质连续倒入柱子时，要用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让介质自然沉降。

（4）柱压不超过0.3Mpa。

（5）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，也最好不含巯基乙醇等还原剂。

（6）在缓冲液中要加入0.15~0.5M的NaCl，以消除离子交换作用。

（7）蛋白被吸附时，经常会有一部分的螯合金属离子被替换，这种现象通常是可见的，所以使用几次后可以先把金属离子洗下来，然后再重新螯合金属离子。

7       再生、清洗、保存

7.1 凝胶的再生

（1）用20mM磷酸缓冲液，0.5M NaCl，50mM EDTA，pH 7.4，冲洗柱子，洗5个柱体积，以洗去残留的Ni²⁺离子；

（2）用至少5倍柱体积的蒸馏水洗柱子，以彻底清洗掉残留的EDTA；

（3）用0.1M NiSO₄过柱子，2-5个柱体积；

（4）用至少5倍柱体积的蒸馏水洗柱子，以彻底清洗没有结合的Ni²⁺离子；

（5）用20%的乙醇过柱子，让填料保存在20%的乙醇环境中。

7.2 在位清洗

（1）除去阴离子交换作用吸附的蛋白，用2~3倍柱床体积2M NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗。

（2）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，用1M NaOH以100cm/h的速度淋洗柱子1h。

（3）所有操作中，都要用至少3倍柱床体积的初始缓冲液洗柱子。

（4）除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4倍柱床体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇洗柱子，再反向淋洗。

8       保存

在20%乙醇中，4℃下长期保存。

 

特别注意：

上样之前，样品必须去除色素，否则色素会被吸附到填料上，影响填料的正常使用。