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层析柱的直径大小不影响分离度,样品用量大,可加大柱的直径,一般制备用凝胶柱,直径大于2厘米,但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外, 直径加大,洗脱液体体积增大,样品稀释度大。分离度取决于柱高,为分离不同组分,凝胶柱床必须有适宜的高度,分离度与柱高的平方根相关,但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞,一般不超过1米。分族分离时用短柱,一般凝胶柱长20-30厘米,柱高与直径的比较5:1─10:1,凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。 分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1,常用凝胶柱有50×25厘米,10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小,如果支掌滤板下的死体积大,被分离组分之间重新混合的可能性就大,其结果是影响洗脱峰形,出现拖尾出象,降低分辩力。在精确分离时,死体积不能超过总床体积的1/1000 [1] 。以中压柱层析法提取分离冬凌草甲素为例:1.吸附剂的处理及柱子装填将一定量薄层层析硅胶装入搪瓷盘置于烘箱中,于105。C活化2H后,取出放置室温即可装柱。柱子采用干法填充,填满整个柱体,不留死体积,密封后用柱塞式计量溶剂泵按丙酮一石油醚(5:95)比例泵入溶剂,至溶剂流出止。2.上样3.洗脱至洗脱完全,相同流份合并,回收溶剂。将冬凌草甲素流份合并蒸干。加入适量甲醇热溶后自然放置,析出结晶,为冬凌草甲素。4.层析柱再生、平衡5.重结晶冬凌草甲素结晶析出完全后,减压过滤,然后用少量甲醇洗涤(洗涤液保留,作下次热溶冬凌草甲素用)。将冬凌草甲素再用适量甲醇热溶后放置,结晶再次析出,待结晶完全后,抽滤,用少量乙醚洗涤,将结晶室温下晾干后置真空干燥箱中,35度真空干燥至恒重。密封于瓶中,置干燥器中保存。6.薄层层析分析
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